前言

在許多生物中，通過基因沉默或編輯已經(jīng)成功地抑制了特定的基因功能，然而，使用細胞毒素基因還沒有實現(xiàn)抑制靶組織功能的遺傳操作。在這里我們建立了具有后部絲腺(PSGs)的轉(zhuǎn)基因蠶，其表達細胞毒素pierisin-1A (P1A)的酶結(jié)構(gòu)域，以此來驗證通過靶向P1A表達的新方法可用于開發(fā)具有組織特異性功能障礙的生物學有用的模式生物。

(資料圖)

截短的P1A在家蠶PSG中的表達和生理影響

白菜蝶衍生的P1A與凋亡誘導體液蛋白Pierisin-1有75%的氨基酸相同，體外翻譯的P1A蛋白表現(xiàn)出ADP核糖基化活性，表現(xiàn)為底物[32P]NAD的ADP核糖基轉(zhuǎn)移到DNA上；然而，反應產(chǎn)物的HPLC分析顯示，與pierisin-1相比，P1A的DNA ADP核糖基化活性為5%～（P < 0.001）。

用載體進行轉(zhuǎn)染實驗，然后用免疫印跡法證實P1A的N端部分含有DNA ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域（P1A269）在昆蟲培養(yǎng)的細胞系，即B. mori衍生的BM-N和Spodoptera frugiperda衍生的Sf21中瞬時表達。

P1A269和全長P1A的異位基因表達對BM-N細胞造成了獨特的非凋亡效應，其特點是扁平細胞數(shù)量的增加和報告蛋白合成的抑制。

為了探索細胞內(nèi)表達的P1A269在特定組織中的功能后果，我們產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因蠶系w1-pndP1A269/P1A269，它攜帶一個均勻的轉(zhuǎn)基因，在纖維蛋白重鏈（FibH）啟動子控制下表達P1A269，這在PSG中特別活躍。P1A269的作用預計僅限于PSG，因為它被設(shè)計成既缺乏P1A從PSG細胞分泌所需的信號序列，又缺乏其侵入靶細胞所需的C端受體結(jié)合域。

反向PCR和DNA數(shù)據(jù)庫分析顯示，該轉(zhuǎn)基因被插入到16號染色體中，通過使用免疫印跡和SDS/PAGE，表達的P1A269蛋白可以在第五齡的第6天在幼蟲PSG中檢測到，這與從環(huán)狀病毒多面體包被的P1A269和表達P1A269的Sf21和BM-N細胞分離的對照樣品相似。

在幼蟲階段，P1A269的蛋白表達在第四齡的第4天和第五齡的第3和第6天增加，但在第五齡的第7天減少。定量RT-PCR也顯示，P1A269的mRNA表達在第五齡期的第3天和第6天增加。

從w1-pndP1A269/P1A269幼蟲中解剖出來的PSG并沒有因細胞凋亡而消亡，而是表現(xiàn)出形態(tài)上的異常，如與未轉(zhuǎn)化的w1-pnd+/+幼蟲的PSG相比出現(xiàn)凹陷。在本研究中，w1-pndP1A269/P1A269的五齡幼蟲在五齡的第6天開始旋轉(zhuǎn)，并在第7天進行腸道清洗后繼續(xù)劇烈旋轉(zhuǎn)。

以前的研究表明，在第五齡期的第3天和第五齡期的后期，PSG中的FibH啟動子活性隨著幼蟲分泌的蛻皮激素脈沖而增加。在第四齡期的第4天，本研究中的幼蟲被認為處于蛻皮階段，此時蛻皮激素脈沖會影響某些基因的表達。

因此，P1A269在第四期幼蟲第4天和第五期幼蟲第3天和第6天的表達可能受蛻皮激素分泌的控制，這表明蛻皮激素脈沖在幼蟲發(fā)育過程中反復誘導P1A269的表達，而這正是PSG的異常出現(xiàn)的原因。

w1-pndP1A269/P1A269蠶的遺傳性狀

w1-pndP1A269/P1A269幼蟲產(chǎn)生的薄層繭殼比w1-pnd+/+幼蟲產(chǎn)生的繭殼重量少79%（P < 0.001），野生型蠶的繭殼由70%的纖維蛋白[FibH和纖維蛋白輕鏈（FibL）]、25%的絲膠蛋白和其他材料組成。

纖維蛋白是專門由PSG生產(chǎn)的生絲成分，而絲膠是主要由中間絲腺生產(chǎn)的膠狀蛋白，通過將纖維蛋白線包圍并粘在一起促進繭的內(nèi)聚力。因此，w1-pndP1A269/P1A269幼蟲制作的繭殼重量減少，被認為很可能是由于纖維蛋白含量減少。

梯度凝膠（5-20%）中的SDS/PAGE，然后用FibL特異性抗體進行免疫印跡，顯示FibL和FibH蛋白存在于w1-pnd+/+幼蟲的繭殼中，但不存在于w1-pndP1A269/P1A269幼蟲的繭殼中，其中只有非纖維蛋白，主要是絲氨酸，可以檢測到（絲氨酸1-4）。

定量RT-PCR分析顯示，相對于w1-pndP1A269/P1A269幼蟲，五齡幼蟲的PSG中FibH和FibL的mRNA水平在相應天數(shù)的第5、6和7天強烈下降。事實上，在第五階段的第7天，w1-pndP1A269/P1A269幼蟲的FibH和FibL mRNA水平分別下降到w1-pnd+/+幼蟲FibH和FibL mRNA水平的3.1%和0.9%（P < 0.001）。

相對于w1-pnd+/+幼蟲的細胞質(zhì)作用A3的水平，同一天w1-pndP1A269/P1A269幼蟲的PSG中的mRNA水平似乎沒有下降。這些結(jié)果表明，細胞內(nèi)表達的P1A269抑制了轉(zhuǎn)基因蠶的PSG中FibH和FibL蛋白的合成。

雄性和雌性w1-pndP1A269/P1A269蛹在化蛹后第三天的平均重量分別比雄性和雌性w1-pnd+/+蛹的平均重量高1.5和1.3倍（P < 0.001）。

這種額外的重量可能是由于保留了原本用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)的營養(yǎng)資源，特別是纖維素，這是蠶繭紡紗所需要的。事實上，在經(jīng)典的實驗中，通過手術(shù)切除第四和第五星幼蟲的絲腺，會在化蛹前造成多余的體液氨基酸，如Gly、Thr、Ser和Tyr的積累，而切除整個絲腺的幼蟲未能化蛹，可能是由于存在多余的氨基酸。

w1-pndP1A269/P1A269蛹在化蛹后沒有表現(xiàn)出明顯的發(fā)育缺陷；到目前為止，這些轉(zhuǎn)基因蠶可以成熟到成年，并產(chǎn)生健康的后代，可以成功繁殖。這些結(jié)果表明，保留用于纖維素合成的營養(yǎng)資源似乎并沒有對轉(zhuǎn)基因蠶產(chǎn)生負面影響。

眾所周知，在第一至第四次蛻皮期間紡出的非繭形絲線可將幼蟲的原腿固定在表面，這種行為對支持幼蟲蛻皮至關(guān)重要。

在本研究中，紡制不含纖維素的非繭絲的幼蟲沒有不脫皮的情況。這一結(jié)果與Takasu等人的證據(jù)一致，即支持幼蟲蛻皮的野生型蠶的非繭絲幾乎不含纖維素，而是主要由絲膠成分組成，特別是絲膠-2。

P1A269等位基因在家蠶育種中的應用

我們接下來建立了KWP1A269/P1A269品系，將養(yǎng)蠶業(yè)使用的商業(yè)蠶株（Kinshu x Showa）與w1-pndP1A269/P1A269品系交配，篩選出遺傳標記（EGFP陽性眼）的個體，然后進行連續(xù)的同胞交配。該商品蠶品系產(chǎn)生的蠶繭比w1-pnd+/+更重。

由此產(chǎn)生的KWP1A269/P1A269幼蟲產(chǎn)生絲膠繭殼，其中FibL和FibH蛋白通過SDS/PAGE和FibL特異性免疫印跡檢測不到。

此外，KWP1A269/P1A269的繭殼比w1-pndP1A269/P1A269的繭殼重1.7倍（P < 0.001），這一結(jié)果表明，將w1-pndP1A269/P1A269品系與蠶遺傳資源數(shù)據(jù)庫（shigen.nig.ac.jp/silkwormbase/top.jsp）中描述的已知能生產(chǎn)重質(zhì)繭的保存品系簡單交配，可用于生產(chǎn)無纖維素的重質(zhì)蠶繭

絲膠繭可用于制備水凝膠

通過對普通蠶繭的生絲脫膠制備的商業(yè)絲膠不能形成水凝膠，因為脫膠過程中的高溫和堿性pH條件導致蛋白質(zhì)分解，使絲膠不再能通過SDS/PAGE檢測到。然而，完整的、可溶性的、不含纖維素的血清蛋白，其濃度可通過SDS/PAGE檢測，可以很容易地使用6M LiBr從w1-pndP1A269/P1A269血清蛋白繭中制備。

然后用10%的乙醇孵育1小時后，可以誘導完整的、可溶性的絲裂霉素形成水凝膠，由于提取的低濃度絲膠溶液中纖維素的污染程度很高，因此不可能用同樣的化學方法從野生型蠶繭中獲得不含纖維素的完整絲膠溶液。

完整的可溶性蠶絲蛋白具有與膠原蛋白相似的保濕特性，并能在高達96%的水的溶液中凝膠化，完整的絲膠蛋白溶液在4℃下長期儲存2-3周后會自主形成水凝膠。在4℃下長期儲存后，絲膠蛋白結(jié)構(gòu)的輕微改變似乎足以促進凝膠化；因此，加入乙醇可能加速了這一過程。

我們以前表明，封裝在多面體中的細胞因子的活性，也就是絲膠蛋白微晶，可以在體外和體內(nèi)環(huán)境中長期穩(wěn)定地維持，并可以緩慢釋放，不斷刺激多種細胞類型的生長和分化。

因此，為了確定絲膠水凝膠是否能作為支架支持細胞生長和分化，我們在絲膠水凝膠上培養(yǎng)小鼠胚胎干（ES）細胞系EB5，該凝膠上覆蓋著含有典型的重組人白血病抑制因子（rhLIF）或加入多面體包裹的LIF的介質(zhì)。

在LIF存在的情況下可以保持未分化的EB5細胞可以增殖，形成特征性的圓頂狀菌落，并表達堿性磷酸酶（ALP）。分化的EB5細胞在含有blasticidin的培養(yǎng)基中不能增殖，本研究中所有的培養(yǎng)都使用blasticidin。

在缺乏多面體的絲膠水凝膠上生長的對照培養(yǎng)物或納入空多面體的培養(yǎng)物中，EB5細胞沒有增殖并形成ALP染色的陽性菌落，從生長在對照水凝膠上的細胞中提取的ALP活性在培養(yǎng)后沒有增加。

相比之下，生長在有多面體包裹的LIF的水凝膠上的EB5細胞和生長在有含rhLIF的培養(yǎng)基覆蓋的水凝膠上的EB5細胞形成了圓頂狀的ALP陽性菌落，其提取的ALP活性分別比在缺乏rhLIF的培養(yǎng)基中加入空多面體的對照水凝膠上生長的細胞高14倍和18倍（P＜0.005；圖3B）；然而，這兩個實驗組之間沒有明顯差異（P＞0.05）。這些發(fā)現(xiàn)表明，只要有LIF，絲膠水凝膠可以作為支持EB5細胞生長的支架。

實驗結(jié)果討論

本研究產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因蠶w1-pndP1A269/P1A269，其中PSG表達P1A的DNA ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)，命名為P1A269。P1A在家蠶細胞中的成功表達可能是由于其相對于強細胞毒性的Pierisin-1的酶活性較低，后者不能在任何種類的活細胞中表達。

細胞內(nèi)表達的P1A269誘導了BM-N培養(yǎng)細胞中報告熒光素酶合成的抑制，在瞬時表達P1A269的BM-N細胞中，看到具有特征性扁平形態(tài)的細胞數(shù)量增加。

因此，BM-N細胞對P1A269的反應似乎與細胞周期停滯有關(guān)，并涉及進入靜止期，這與蛋白質(zhì)合成受損和激活應對DNA損傷的凋亡途徑有關(guān)。

同時，P1A269誘導PSG細胞中FibH和FibL mRNA水平的下降，PSG細胞不增殖，但在幼蟲階段體積增長，表明P1A269具有抑制FibH和FibL基因轉(zhuǎn)錄的功能。

細胞質(zhì)肌動蛋白A3 mRNA水平?jīng)]有因為P1A269的功能而下降，表明P1A269抑制了一些基因的轉(zhuǎn)錄，包括與引入的P1A269的表達同時啟動的纖維蛋白基因。因此，看來P1A269誘導的對一些基因的抑制可能是PSG細胞生長的原因，并導致觀察到的形態(tài)異常。

P1A269的功能表面上看來是誘導了細胞質(zhì)肌動蛋白A3 mRNA水平的增加，然而，由于P1A269的功能估計會抑制PSG中rRNAs轉(zhuǎn)錄率的大幅增加，據(jù)報道這與纖維蛋白的合成同時發(fā)生，因此最好認為該結(jié)果是一個不切實際的，從數(shù)據(jù)的正?；絇1A269改變的18S rRNA水平出現(xiàn)的數(shù)字事件。

到目前為止，在用細胞外的Pierisin-1處理哺乳動物細胞后，沒有觀察到除細胞凋亡外的其他細胞反應，因為Pierisin-1可以進入目標細胞。

因此，只有細胞內(nèi)表達的P1A蛋白才有望誘發(fā)特征性的細胞反應，包括對細胞蛋白合成的抑制，這表明細胞內(nèi)表達的P1A N端結(jié)構(gòu)域可以引起位點特異性的非凋亡效應，既不會擴展到鄰近的組織，也不會對個體的發(fā)育階段產(chǎn)生影響。

P1A也可以在它誘導蛋白合成抑制的任何細胞中有效。因此，細胞內(nèi)表達的僅編碼N端酶活性區(qū)域的P1A可用于產(chǎn)生具有組織特異性功能障礙的模型生物，適用于各種遺傳操作，包括在哺乳動物的癌細胞中誘導靜止，以及開發(fā)用于糖尿病研究的胰島功能受損或免疫系統(tǒng)功能受損的動物模型。

然而，為了將來在其他生物體內(nèi)應用細胞內(nèi)表達的部分P1A，我們必須首先了解P1A片段如何通過抑制蛋白質(zhì)合成而不是誘導細胞凋亡來誘導PSG功能障礙。一種可能性是，細胞中一定水平的DNA ADP核糖基化需要抑制蛋白質(zhì)的合成，但超過這個水平就會誘發(fā)細胞凋亡。

與BM-N細胞相比，P1A269在Sf21細胞中的表達更強烈，在那里它能刺激其凋亡的細胞死亡，這一觀察支持了這一假設(shè)。因此，未來的研究需要調(diào)查在PSG中發(fā)生的蛋白質(zhì)合成抑制是否取決于表達的DNA ADP核糖化活性的強度，以及如何通過調(diào)節(jié)控制P1A269表達的啟動子或引入P1A269的氨基酸突變來調(diào)節(jié)P1A活性。

這項研究還發(fā)現(xiàn)，w1-pndP1A269/P1A269幼蟲紡出的繭幾乎不含纖維素，幾乎完全由絲膠組成。以前的一項研究表明，表達Bcl-2相關(guān)的X蛋白的蠶PSG會變得消融，盡管這項研究沒有提出關(guān)于繭和化蛹后被操縱個體的發(fā)展的信息。

此外，一份描述轉(zhuǎn)基因蠶的T7 RNA聚合酶修飾的PSG的單獨報告顯示，F(xiàn)ibL和FibH的表達減少但可以檢測到，而另一項研究顯示，轉(zhuǎn)錄激活劑樣效應核酸酶介導的FibH基因中斷的蠶產(chǎn)生的薄層蠶繭不含F(xiàn)ibH，但FibL的水平正常。

Nd蠶株有一個影響絲腺的天然基因突變，產(chǎn)生少量的蠶繭，這些蠶繭有非常多的絲膠和不同比例的纖維素。我們的研究報告使用了一種細胞毒素，導致抑制PSG功能產(chǎn)生FibH和FibL，以及生產(chǎn)僅由絲膠組成的蠶繭。