“開始做這個項目時，我的預(yù)期是2020年能做出來就很不錯了。” 中國科學院神經(jīng)科學研究所(以下簡稱“中科院神經(jīng)所”)所長蒲慕明告訴科技日報記者。

中科院神經(jīng)所研究員孫強從蒲慕明那接到體細胞克隆猴任務(wù)時，給自己和團隊的時間是十年。事實上，他們僅用了五年就做出讓學術(shù)界矚目的成果。

2017年11月27日，世界上首只體細胞克隆猴“中中”在中科院神經(jīng)所、腦科學與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心的非人靈長類研究平臺誕生;同年12月5日，第二只克隆猴“華華”誕生。這一成果標志著中國率先開啟了以體細胞克隆猴作為實驗動物模型的新時代。

今年1月份，孫強團隊與同屬于中科院神經(jīng)所的張洪鈞團隊合作，再獲佳績：在張洪鈞團隊利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功構(gòu)建世界首批核心節(jié)律基因BMAL1敲除獼猴模型的基礎(chǔ)上，孫強團隊通過一只癥狀最明顯的公猴的體細胞克隆出五只小猴。這項進展說明中國科學家已可以批量生產(chǎn)遺傳背景均一的疾病獼猴模型。

夢寐以求多年但無法達成的目標

遺傳背景單一的非人靈長類動物模型是科研人員夢寐以求多年但無法達成的目標。

“用小鼠做藥效檢測，可以剔除遺傳背景因素，更好地觀察藥效。”蒲慕明說。但是，由于小鼠的基因、代謝和腦組織結(jié)構(gòu)和生理等方面與人類差別太大，部分藥物作用在人類和小鼠上的效果也差別巨大，相比之下，與人類基因更接近的靈長類動物顯然是更好的動物模型。

非人靈長類動物首選對象肯定是猴子?？墒且吧锏倪z傳背景各異、個體表征差異難統(tǒng)一，每次科學實驗或藥物檢測的對照驗證，需要使用大量實驗猴，而且野生猴繁殖周期長、單胎數(shù)量少，驗證工作常常持續(xù)很多年，時間過于漫長。所以想將其作為動物模型，最大的難題就是如何獲得遺傳背景相同的猴子。

“小鼠繁殖很快，自然繁殖幾代后它們的遺傳背景就相同了。猴子繁殖一代就要五六年，所以唯一的辦法就是克隆。”蒲慕明說。

但克隆猴太難了。美國、中國、德國、日本、新加坡和韓國等世界科研機構(gòu)都在攻關(guān)非人靈長類體細胞克隆，均未成功。此前，體細胞克隆猴最接近成功的一次是在2010年，美國俄勒岡靈長類研究中心在給代孕猴媽媽胚胎移植后的第81天發(fā)生流產(chǎn)。“只有獲得遺傳背景相同的克隆猴，才能最大程度發(fā)揮平臺的作用，真正推進相關(guān)藥物的研發(fā)。美國科學家還差一半就成功了。我們也很有希望成功，但要做好剩下的一半。”蒲慕明說。

超高實驗技巧完成艱難的“另一半”

剩下的“另一半”卻遠比想象艱難許多。

孫強分析，在體細胞克隆猴技術(shù)具體操作上，主要有兩大難點。第一點，“拿掉細胞核的時候不能抽掉周圍太多營養(yǎng)物質(zhì)，否則細胞就不發(fā)育了”。此外，移植到卵細胞中的，是成熟的、只表達某些特定基因的體細胞細胞核，研究人員需要想辦法讓它重新變成一個未分化的全能胚胎細胞。

孫強解釋道，由于猴子細胞不透明，在顯微鏡下看不到細胞核，需要通過偏振光才能把細胞核顯示出來。在孫強團隊的研究記錄視頻中，研究人員注視著顯微鏡，在一閃一閃的偏振光下，操縱10微米左右直徑的極細針頭在細胞里吸取、注射，并盡可能減小對細胞的損傷，其難度遠大于操縱繡花針。

除了去核要求速度快外，將體細胞核注入去核卵細胞同樣要求非常快，“我們的團隊成員可以做到15秒內(nèi)實現(xiàn)體細胞注入操作，只有精湛的技術(shù)才可以保證對卵細胞損傷最小。”孫強說。

第二點，在核基因組啟動前，體細胞核要經(jīng)歷一個回復(fù)到早期胚胎核狀態(tài)的過程，也就是重編程。只有將這個過程控制好，才能提高體細胞胚胎的發(fā)育率。在嘗試各種調(diào)控方法效果均不理想后，2014年，孫強團隊在一篇報道中看到一種新的酶處理方法，并最終用這一方法將囊胚率提升到45%，優(yōu)質(zhì)胚胎率升高到29%。最終，孫強團隊用127枚卵母細胞，做了109個重構(gòu)胚胎，對21只猴子受體進行移植，獲得6只懷孕受體，最后只有兩只在2017年順利出生。

“這個工作證實了獼猴可以用體細胞來克隆，并且，它可以成為有用的動物模型。”蒲慕明認為。

將構(gòu)建足夠數(shù)量的疾病模型猴

短短一年后，中科院神經(jīng)所科研團隊再次用體細胞克隆技術(shù)生成了5只遺傳背景相同的模型猴——世界首批核心節(jié)律基因BMAL1敲除獼猴模型。記者在中科院神經(jīng)所非人靈長類研究平臺看到，一只半歲多的猴子，躲在孵育箱角落里。它就是神經(jīng)所科研團隊創(chuàng)建的世界首例生物節(jié)律紊亂猴克隆后代之一。

生物節(jié)律的基礎(chǔ)研究與轉(zhuǎn)化干預(yù)目前亟須好的生物模型。2016年9月，張洪鈞團隊首次利用基因修飾方法，得到一批生物節(jié)律核心基因BMAL1缺失的獼猴。

然而，通過基因敲除方法獲得的第一代模型猴，容易產(chǎn)生嵌合體，這成了研究的最大阻礙。由于這一批猴的生物節(jié)律紊亂嚴重程度不一致，無法作為理想的動物模型。隨著“中中”“華華”的誕生，研究人員開始思考，能否利用克隆猴技術(shù)，構(gòu)建出疾病模型猴?

孫強團隊馬不停蹄，在國際上首次獲得5只遺傳背景一致的生物節(jié)律紊亂克隆猴。

“這個成果比首例體細胞克隆猴更進一步的地方在于，上次用的是流產(chǎn)胚胎的體細胞，這次用的是活猴的體細胞來克隆的，可以在兩代猴之間進行比對。”蒲慕明說，更重要的是，此次克隆的是一種有疾病表型的猴，這首次證實通過體細胞核移植技術(shù)可以克隆成年基因修飾猴，進一步表明克隆猴作為疾病模型的有效性。

“這些腦疾病模型克隆猴，未來將有助于解析腦重大疾病的致病機理、確立預(yù)警和早期診斷指標、進行干預(yù)和治療等。建立基于疾病模型猴的非人靈長類平臺，將成為中國腦計劃的一大亮點。”蒲慕明表示。